25. Синтез ведущей и отстающей цепей днк.
Инициация. Подготовка ДНК матрицы. Точки начала репликации на молекуле ДНК – ori-сайт — имеют специфическую последовательность оснований, богатую парами А-Т. Процесс начинается с того, что с каждой такой последовательностью связываются несколько молекул специальных узнающих белков (у прокариот это белки DnaA). Далее геликаза осуществляет денатурацию ДНК, а топоизомеразы снимают напряжение еще не раскрученной ДНК. SSb-белки с свою очередь препятствуют обратной ренатурации ДНК.
Элонгация. Синтез ДНК цепей. Репликационная вилка разделяется на отстающую цепь и лидирующую. Т.к ДНК-полимераза может работать только направлении 5’3′, то на лидирующей цепи синтез идет непрерывно. Отстающая цепь образуется в виде фрагментов Оказаки. ДНК-полимераза III доходит до РНК-затравки предыдущего фрагмента Оказаки и отделяется. Ей на смену приходит ДНК-полимераза I, которая осуществляет последовательное отщепление нуклеотидов с 5’-конца РНК-затравки предшествующего фрагмента.
Терминация. Окончание синтеза. ДНК-лигаза соединяет фрагменты Оказаки, а гираза закручивает цепочки ДНК в спираль. РНК-полимераза I (прокариот), (РНКазаН у эукариот) — удаляет РНК-праймеры. Теломераза достраивает теломерные участки хромосом эукариот.
25. Сравните процесс репликации у прокариот и эукариот.
— у эукариот репликация идет в S-период митотического цикла в ядре и ДНК содержащих органоидах.
— молекула ДНК у эукариот – полирепликон. У прокариот – монорепликон.
— скорость репликации у эукариот 50нукл. в сек. у прокариот – 500нукл. в сек.
— длина фрагментов Оказаки у эукариот – 100-200пар нукл., у прокариот – 1000-2000 пар нуклеотидов.
— у эукариот присутствует проблема недореплицированности. Наличие теломер решает проблему недореплицированности концов линейных молекул. (у прокариот кольцевая молекула)
26. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Условия проведения ПЦР. Этапы процесса.
ПЦР – молекулярный генетический метод получения in vitro большого количества копий определенного фрагмента ДНК.
— R-праймаза. ДНК-праймер. 1мкл
— L-праймаза. ДНК-праймер. 1мкл
— dNTP (дезоксирибонуклеотидтрифосфат) – 5мкл
— дистиллированная вода 22 мкл
Смесь помещают в амплификатор на 1.5-2 часа.
1 этап: Денатурация ДНК. Протекает при 93-94°С в течение 30-40 сек. Происходит разрушение водородных связей.
2 этап: Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах соответствующего участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65 градусов. Время отжига 20-60 сек.
3 эпап: Достраивание цепи (элонгация). Комплементарное достраивание цепей происходит от 5’-конца к 3’-концу в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей служат добавляемые в раствор нуклеотиды. Синтез происходит при температуре 70-72 С, время синтеза – 20-40 сек. Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для нового цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом, происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n- число циклов амплификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась всего одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 10 8 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле. Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации.
27. Составьте схему амплификации фрагмента ДНК с помощью ПЦР.
28. Детекция результатов ПЦР.
После амплификации ДНК-фрагмента с помощью ПЦР, фрагмент гидролизуют подходящей рестриктазой. Фрагменты разделяют гель –электрофорезом, а интересующий фрагмент выделяют с помощью специфичного генного зонда.
Генный зонд – это молекулы ДНК или РНК, меченные радиоактивными изотопами.
29. Области применения ПЦР.
Клиническая лабораторная диагностика
• диагностика вирусных инфекций (ВИЧ, гепатит, половые инфекции и др.)
• диагностика генных болезней (выявление мутаций)
• судебная медицина (напр. идентификация личности)
Фундаментальная наука и практика
• секвенирование (определение нуклеотидной последовательности, меченые атомы)
• генная инженерия (создание трансгенных животных и растений)
30. Изменчивость как свойство живых организмов. Классификация изменчивости. Биологическое значение изменчивости.
Изменчивость — разнообразие признаков среди представителей данного вида, также свойство потомков отличаться от родительских форм.
1. Модификационная или фенотипическая изменчивость. Охватывает изменения признаков, которые происходят под влиянием условий развития или факторов внешней среды. Является ненаследственной.
Характеризуется следующими особенностями:
— развитие в сходных условиях носит групповой характер проявления признака.
— изменчивость носит обратимый характер.
— влияние среды может изменить проявления признаков на основе наследственного проявления нормы реакции. Норма реакции – свойство данного генотипа обеспечивать в определенных пределах развитие данного онтогенеза в зависимости от меняющихся условий внешней среды.
2. Комбинативная изменчивость. Изменчивость, которая возникает вследствие рекомбинации генов во время слияния гамет. Является наследственной.
— независимое расхождение хромосом во время мейоза;
— случайная встреча половых гамет, а вследствие этого и сочетания хромосом во время оплодотворения;
— рекомбинация генов вследствие кроссинговера.
3. Мутационная изменчивость. Изменчивость, вызванная действием на организм мутагенов, вследствие чего возникают мутации (реорганизация репродуктивных структур клетки). Мутагены бывают физические (радиационное излучение), химические (гербициды) и биологические (вирусы).
Фенотипическая изменчивость является главным фактором приспособления организмов к изменяющимся условиям внешней среды.
Наследственная изменчивость поставляет материал для эволюционного процесса.
31. Комбинативная изменчивость. Механизмы возникновения. Рекон.
Комбинативная изменчивость – изменчивость, которая возникает вследствие рекомбинации генов во время слияния гамет. Является наследственной.
— независимое расхождение хромосом во время мейоза;
— случайная встреча половых гамет, а вследствие этого и сочетания хромосом во время оплодотворения;
— рекомбинация генов вследствие кроссинговера.
Рекон — элементарная единица генетической рекомбинации, или минимальное расстояние между двумя точками хромосомы, в пределах которых возможна рекомбинация. Термин введён в 1957 американским генетиком С. Бензером.
32. Мутации. Мутон. Классификация мутаций.
Мутация — изменение генотипа, происходящее под влиянием внешней или внутренней среды. Термин предложен Гуго де Фризом. Процесс возникновения мутаций получил название мутагенеза.
Мутон – наименьший участок ДНК, изменение которого приводит к мутации.
В зависимости от размера поврежденного участка ДНК выделяют генные, хромосомные и геномные мутации. По локализации в клетке – соматические и генеративные (наследственные мутации, которые переходят в сегрегационный груз). Полезные мутации, вредные или нейтральные (оценивает естественный отбор).
Мутации также делятся на спонтанные и индуцированные. Спонтанные мутации возникают самопроизвольно на протяжении всей жизни организма в нормальных для него условиях окружающей среды с частотой около 10 −9 — 10 − 12 на нуклеотид за клеточную генерацию.
Индуцированными мутациями называют наследуемые изменения генома, возникающие в результате тех или иных мутагенных воздействий в искусственных (экспериментальных) условиях или при неблагоприятных воздействиях окружающей среды.
Источник
18.На лидирующей цепочки синтез днк идет непрервыно.
Сначала образуются праймеры(затравки) маленькие моллекулы РНК. Праймеры синтезируются комплексом праймосомой. Праймосома -состоит из двух компонентов Днк-геликаза и РНК-полимераза(фермент праймаза).
У праймеров есть 5′ и 3′ конец. К 3′ концу будет присоединяться ДНК-полимераза и будет строить.
После этого нужно убрать праймеры. Приходит ДНК-полимераза I и убирает праймеры, по одному нуклеотиду РНК. После того как она убрала один нуклеотид РНК она выстраивает нуклеотид ДНК. Когда она заменила все нуклеотиды на ДНКовые и дошла до фрагмента Оказаки и теперь лигаза их будет соединять.
Ферменты репликации
ДНК-геликаза производит денеатурацию моллекулы ДНК
ДНК — топоизомераза снимают топологическое напряжение,возникающие из-за расплетения ДНК. Снимаеют суперсперализацию перед репликативной вилкой.
ДНК-полмеразы I удаляет нуклеотиды РНК и достраивает нуклеотиды ДНК. Обладает 3′-экзонуклеазной активностью.
-II обладает низкой полимеразной активностью. Участвуеют в репарации ДНК
—III — синтезирует ведущую цепь и фрагменты оказаки.приходит к 3′ концу. Синтезирует в направлении 5′ ->3′
ДНК-лигаза будет соединять фрагменты Оказаки с фрагментом на котором прошел синтез ДНК с помощью ДНК-полI
ДНК-гираза — участвует в закручивании спирали.
ПЦР — это один из моллекулярно-генетических методов получения в пробирке(in vitro) большого количества определ. фрагмента ДНК.
Чтобы провести р-цию нужно знать длину нуклеотидов, 20 нуклеотидов на концах, чтобы приговить праймеры.
35-40 циклов (1,5 часа) в приборе амплификатор.
6) дезоксиридонуклеозидтрфосфаты 5
Протекает при 93-94 С в течение 30-40 сек.
2.Присоединение праймеров (отжиг)(ренатурация)
Соединение праймеров с комплиментарными последовательностями ДНК.
При 50-65 С(медленно понижают Т). время 30 секунд(40,20-60)
Элонгация (достраивание цепи)
температура 70-75 С время около 1 минуты.
Генетический код – это система записи последовательности аминокислот полипептидной цепи в виде последовательности нуклеотидов ДНК или РНК.
Свойства генетического кода
Вырожденность (избыточность)-большинству аминокислот соответсвует больше,чем один триплет
Неперекрываемость-кажд.нуклеотид входит лишь в состав 1ого триплета
Непрерывность-между линейно располож. Триплетами нет никаких физич. интервалов
Универсальность-кодоны м-РНК,опред.аминокис.последовательность полипептида,имеют одинаков. Смысл для разн.уров.организаций
Коллинеарность-соответствие между последовательностью кодирующих триплетов ДНК и последовательностью аминокислот в полипептидной цепи.
Синтез молекул рнк в клетке.приципы этапы транскрипции.
Транскрипция-это синтез РНК на ДНК-матрице.
2)Образование открытого двойного комплекса
3)синтез первой фософодиэфирной связи->образов тройного комплекса.
Промотор-участок ДНК на котором начинается транскрипция.
-10 Прибнов бокс ТАТААТ-Рнк пол высчитывает где наход точка +1
-35 участок узнавания ТТGACA
РНК-пол называется Кор-фермент состоит из 4ех субъединиц ααββ‘.
РНК полимераза прикрепляется большей частью за область узнавания,т.к. Если она узнает только одну область она не будет знать в какую сторону ей идти.
Как только она распознает обе области определяется цепь на коорой будет идти синтез РНК. Синтез идет на цепочке 5′ 3′.
У холофермента есть 4 активных центра:перед-разрезания(геликазной активности),задний-соединения(лигазной активности),нижний и верхний центр удерживают цепочки ДНК.
На матричной цепочке начинается синтез.
После того как прикрепилось несколько нуклеодитов уходит сигма-фактор.
Источник